Vitrifikation und aseptische Vitrifikation

Vitrifikation

Während des Tiefgefrier- und Auftau-Vorganges muss unbedingt die Bildung von Eiskristallen vermieden werden, da diese inkompatibel mit dem vitalen Zellensystem sind. Aus diesem Grund wird seit einigen Jahren zur Kryokonservierung von Eizellen/Embryonen sehr erfolgreich die Methode der Vitrifikation angewandt.

Unter Vitrifikation versteht man das Erreichen eines glasähnlichen, amorphen Zustandes, durch den Einsatz bestimmter Kryoprotektiva in hohen Konzentrationen und durch sehr schnelles Abkühlen (zwischen 1000°C/min bis 20.000°C/min bei der Vitrifikation verglichen zu 0.3°C/min bei der „Slow freezing“ Methode).

Da die Zellen direkt in einen amorphen Zustand (Verglasung) übergehen können Schädigungen am Spindelapparat und an den Chromosomen (bedingt durch Eiskristallbildung) vermieden werden.

Aseptische Vitrifikation

Um möglichst hohe Abkühlraten während der Vitrifikation zu erreichen, werden Eizellen in einem sehr kleinen Volumen von Vitrifikationslösung auf einen offenen Träger gesetzt, der direkt in flüssigen Stickstoff getaucht wird. Diese „offenen“ Straws sind einer der Hauptkritikpunkte in der Vitrifikation, da die Zellen in direkten Kontakt mit flüssigem Stickstoff kommen und so dem Risiko einer Kontamination mit Pathogenen und der Schädigung durch toxische Substanzen im flüssigen Stickstoff ausgesetzt sind.

Mit der Einführung der EU-Direktive für Gewebe und Zellen im Jahr 2006 wurden bei der Kryokonservierung von Gewebe bestimmte Sicherheitsanforderungen gestellt. Seither ist die Verwendung eines geschlossenen, aseptischen Systems bei der Vitrifikation obligat.

Um diesen hohen Sicherheitsanforderungen entsprechen zu können, haben wir eine Methode zur aseptischen Vitrifikation von Eizellen entwickelt, bei der gemäß der gesetzlichen Vorgabe die Vorteile der Vitrifikation für die Kryokonservierung genutzt werden kann.

Eine Herausforderung bei der Entwicklung der Methode war die Wärmeisolierung im aseptischen Straw, da es bei der aseptischen Vitrifikation zu einer Reduktion der Abkühlrate von >20.000°C/min auf <2000°C/min kommt. Zunächst wurden die Zellen schrittweise mit höherkonzentrierten Lösungen von Kryoprotektiva inkubiert, wodurch die intrazelluläre Konzentration dieser Stoffe erhöht und damit der osmotische Stress verringert werden konnten.

Da alle verwendeten Kryoprotektiva potentiell toxisch auf Zellen wirken und die relativ hohen Mengen, die bei der Vitrifikation eingesetzt werden oft kritisiert werden, haben wir die für die Eizellen relevante intrazelluläre Konzentration gemessen. Obwohl die Zellen bei der aseptischen Methode über eine längere Zeitspanne diesen Lösungen ausgesetzt sind, konnten wir nachweisen, dass die intrazelluläre Konzentration an Kryoprotektiva, im Vergleich zu Protokollen für das „offene“ Vitrifikations-System, noch immer niedrig ist und unter jener liegt, die beim„Slow freezing“ entsteht.

Unsere Daten zeigen, dass die aseptische Vitrifikation mit dem VitriSafe eine sehr effiziente und sichere Methode zum Tiefgefrieren von Eizellen darstellt. Trotz Reduktion der Abkühlrate aufgrund der Wärme-isolierung durch Einsatz der aseptischen Vitrifikation kommt es zu keinen Einbußen in der Vitalität und im Entwicklungspotential der Zellen.

Ein wichtiger Faktor ist das Beibehalten der hohen Erwärmungsraten während dem Auftauprozess. Die von uns entwickelte Methode berücksichtigt die Anforderungen der EU-Direktive und schützt die Zellen vor Kontamination mit Pathogenen und dem Kontakt mit toxischenVerbindungen während der Vitrifikation und der Lagerung im flüssigen Stickstoff.

Diese Methode der Vitrifikation mittels VitriSafe ist dem „Slow freezing“ deutlich überlegen.

Neues & Wissenswertes

http://www.guardian.co.uk/science/2011/oct/18/eggs-frozen-young-women
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